V molekularni biologiji je dobra izbira pufra in priprava na različne korake izolacije DNA lahko razlika med prehodom na ekspresijo beljakovin ali odpiranjem drugega maxi-prep kompleta za začetek. Kljub odločilnemu pomenu so puferski recepti pogosto le recepti, napisani brez razlage ali utemeljitve za različne komponente. Eden od teh pufrov je glukoza-tris-EDTA ali GTE pufer.
$config[code] not foundKaj je uporabljena GTE?
GTE se uporablja za resuspendiranje bakterijskih celičnih peletov pred liziranjem (razkrajanjem) celic in spravilom plazmidne DNA v notranjost. Lizocim, ki mehča celične membrane, se pogosto doda skupaj z GTE puferjem. Doseganje homogene suspenzije celih celic v tem koraku, tako da lahko kasneje dodana raztopina lize pride do vseh celic, je ključnega pomena za doseganje dobrih rezultatov DNA. GTE je zasnovan za to, hkrati pa zagotavlja stabilno okolje za DNK.
Glukoza za Osmolarnost
50 mM (milimolarnega) glukoznega sladkorja dodamo v GTE pufer, da ohranjamo osmolarnost, kjer je koncentracija topila zunaj celic blizu tiste znotraj celic. To preprečuje prezgodnjo lizo celic, ki lahko povzroči nižje donose DNA zaradi agregacije in razgradnje. Ostale sestavine pufra prav tako prispevajo k osmolarnosti raztopine, vendar je glukoza, ki je neelektrolit, dobra izbira, ker ne vpliva na lastnosti raztopine pufra.
Tris za stabilnost pH
Tris je kratko ime za tris (hidroksimetil) aminometan, ki je zelo pogost pH pufer. V primeru GTE pufra dodamo kislinsko sol (Tris-HCl) pufru pri koncentraciji 25 mM. To ohranja pH raztopine pri skoraj fiziološkem 8,0, idealnem pH za preprečevanje kislinske hidrolize (razgradnje) plazmidne DNA in neželenih stranskih reakcij drugih celičnih komponent.
EDTA preprečuje razgradnjo DNA
EDTA ali etilendiamintetraocetna kislina ujame ali "izloča" kovinske ione iz raztopine, kar jim preprečuje, da bi sodelovali v neželenih stranskih reakcijah. V GTE pufru dodamo EDTA pri 10 mM. Njegov primarni namen je v pufru, da zaokroži prosti cink, magnezij in kalcij in tako prepreči razgradnjo DNK z določenimi potmi, ki zahtevajo te kovine.
Nekateri pomembni nasveti
GTE hranilnik ohladite in ga naredite v majhnih količinah, da preprečite rast nenamernih bakterij v njem. Sladkor in nadzorovan pH sta odličen medij za rast. Vedno uporabljajte prečiščeno vodo. Voda iz vodovoda ima lahko iz cevi presežek kovinskih ionov, kar lahko preplavi sposobnost zajemanja EDTA. Če sumite na prisotnost moteče RNA v vašem vzorcu, dodajte RNase A na 100 mikrogramov na mililiter v vaš GTE pufer, da odpravite težavo.
